プロテアソーム関連の研究をしているんですが、
「ある抗原(何でもよい)がプロテアソームで分解されて、そのペプチドがMHCに提示される」
というのをある程度、定量的に測定する最も簡便なアッセイ系を教えて下さい。
ある遺伝子や薬剤が、プロテアソーム活性を制御することで、MHCへの抗原の提示能を抑える、ということを示したいわけです。
モデル抗原は何でもいいので、(出来れば、ガン抗原やウィルス抗原だと嬉しい)
キットみたく簡単なアッセイであればあるほど嬉しいです。
一例としては、
あるペプチド断片がMHCと結合した状態を認識する抗体などがあれば、
FACSで、表面でMHCとペプチドが結合した細胞だけをカウント出来るので、そんな感じの簡便なアッセイ系は無いかなあ？と。
No.1
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今はフローサイトメトリーで測定してるんですよね？
かなり操作は複雑だと思うのですが(^-^;
今はこれを使って、ペプチド複合体の数を蛍光色素定量ビーズを用いて定量分析する方法を用いてるっていうことでしょうか
RT-PCR法でMHC関連遺伝子の発現量を因子定量などで測定するのはいかがですか？
http://www.promega.co.jp/lit/cytotox.html
製品資料 : CytoTox96 - プロメガ株式会社
こういうアッセイもあるようですが・・・値段がちょっと良く分かりませんね(^-^;
No.2
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特に新しい情報ではないのでお役に立たなければポイントは結構です。
個人的には普通の動物実験施設が使える設備さえあれば、
aki73ixさんが紹介されているPromegaのkitがRIを使わなくてもいいし、
一番お手軽なんじゃないかと思います。
マウスを使うのがお嫌でしたら、T細胞のハイブリドーマを使うというのはどうでしょう。
いずれにしてもプロテアソームによる分解→抗原提示に先だってIFNでの刺激が必要かと思いますので
それをエフェクターT細胞にさせるかわりにハイブリドーマにさせられないかと。
問題は上記URLのような抗原特異的なハイブリドーマを自分で作らずに入手できる経路があるか、ということですね。
自分で作るのだったら普通にキットでキラー活性をはかった方が早いですものね。
あるいは１．で否定されていましたが、
たとえば遺伝子ならそれを持たない細胞にトランスフェクションで発現させ、IFNでの刺激を行った後に、RT-PCRでプロテアソームサブユニットをコードするTAP遺伝子の発現を定量的に調べるというのはどうでしょう。
薬剤なら添加した細胞としない細胞で比較するとか。
直接的な抗原提示の証明にはならなくても傍証にはなるかと思います。
その遺伝子や薬剤はプロテアソーム活性を転写レベルで調節しているのではないんでしょうか。
詳しい方っぽいので、追記あれば教えて下さい。
そうそう、結局その後自分でも更に調べましたが、
前者のやり方の一つとして、アルブミンと、そのアルブミン抗原ペプチドに対するT細胞ハイブリドーマを使ってる人が多いんです。
だから、そのハイブリドーマを誰かから譲ってもらえないか、ボスに交渉してもらう予定です。
ただ、慣れないそんな実験より、
もし、表面抗原ペプチドをFACSでカウントするだけなら、今までの実験の延長線でラクに実験出来ると思っているので、そういう系は無いのか？とまだ模索中です。
ちなｍにに、2つ目のやり方は今回は全く無意味でs。
薬剤か遺伝子かということは伏せますが、
作用機構は、プロテアソームのサブユニットに結合して活性を阻害する、なので。
転写レベルを見ても意味が無いです。
じゃ、分かりやすく簡潔にした例として示すと、
プロテアソームインヒビターが、MHCクラスIへの抗原提示を抑える
というのを簡単に示せる細胞レベルでの実験系
というのが欲しいのです。
もう回答が来そうにないので、終わりにします。
やっぱりそういうアッセイ系は無いのか、ということで諦めます。
どうもありがとうございました。
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最初のものは、ちょっとよく分かりませんね。
ほんとにMHC-ペプチド複合体を認識してるのか、認識するならどんな抗体のついたビーズを使ってるのか…
追加情報があれば知りたいです。
MHC関連遺伝子の発現、というのは今知りたいことではないので。
ある抗原が分解されて提示されるということが起こらない、という実験をしたいので。実際関連遺伝子の変化は無いはずです。
3つ目のやり方は、僕が論文で調べた中の、もっともメジャーなやり方を踏襲しているんですが、
ようは、マウスの脾臓に抗原を注射して得られた細胞障害性T細胞を用意しておいて、
それによって、抗原提示した細胞を殺して、数を調べる、ってやり方ですよね。
うちのラボでは、そんな免疫の基礎実験をやるのは面倒なので、
そのT細胞の代わりに、もし複合体や抗原ペプチドを認識できる抗体があるのなら、
FACS(ビーズでもいいですが)などの方法で簡便に調べられるかなあ、と思って。
これは、と思う方にはめちゃくちゃポイントは差し上げますので、
(1000ポイントくらいでもいい)
よろしくお願いします。